Déploiement du MACSima

Ce projet de recherche, qui m'a permis de valider mon Master 2 Biologie de la Reproduction, s'est principalement construit autour de la technologie MACSima développée par Miltenyi. Le développement embryonnaire présente une cytologie particulière. Les cellules ont des dynamiques de différenciation et de migration importantes.

La transcriptomique spatiale a au départ permis d'obtenir une cartographie transcriptionnelle et a pu définir ces trajectoires et destins cellulaires. La microscopie 3D iDISCO, elle, a permis l'étude spatiale et morphologique globale de l'embryon. Mon objectif était d'intégrer la protéomique spatiale avec le MACSima pour obtenir une analyse multi-échelle. J'ai obtenu deux marquages de coupes embryonnaires entières PCW8 au niveau de la région hypogastrique. Ces coupes ont été marquées avec plus de 60 marqueurs.

J'ai évalué et calibré les données, en commençant par la segmentation. En partant d'une segmentation manuelle, j'ai développé différents pipelines Python. Ces pipelines m'ont permis, dans un premier temps, de valider et d'optimiser la segmentation. De plus, en l'intégrant dans du Machine Learning, j'ai pu rendre cet apprentissage automatique et plus performant. Une fois les données validées, j'ai entrepris des pipelines d'isolation et de caractérisation cellulaires. J'ai également pu caractériser l'organe de Zuckerkandl et la trajectoire des cellules Syk+ dans la dure-mère.

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L'utilisation des marqueurs se construit sous forme de panel. Il permet de définir quel marqueur, dans quel fluorophore et dans quel cycle. Les cycles ont aussi leurs caractéristiques propres dans leur durée. S'il est trop court, il ne permet pas un marquage optimal. Si l'effacement n'est pas optimal, on maintient la persistance du marquage pour le cycle suivant. Il est nécessaire de concevoir des programmes d'optimisation pour avoir une vision globale des cycles et de leur enchaînement. J'ai opté pour une plateforme HTML avec un fichier CSV. Elle repose sur un catalogue d'anticorps que l'on peut filtrer et sélectionner pour la création d'un panel. De plus, on peut y stocker les expériences passées avec, pour chacune, les observations et recommandations pour les futures expérimentations.

J'ai réalisé deux acquisitions sur deux coupes embryonnaires à 8 PCW (Post-Conception Weeks). Les marqueurs ont couvert une large gamme de catégories : neuronaux, facteurs de transcription, épithéliaux, mésenchymateux, musculaires, vasculaires, lymphatiques, immunitaires et inflammatoires.

MACiQView intègre plusieurs programmes de segmentation automatique. Pour les valider, j'ai créé un pipeline de comparaison des distributions entre les données issues d'une segmentation manuelle et des segmentations automatiques. J'ai utilisé le test de Kolmogorov-Smirnov puis la bibliothèque Isolation Forest, un algorithme de machine learning. Il apprend à détecter les segmentations corrects à partir des données manuelles. Il identifie ensuite les cellules mal segmentées dans les résultats automatiques. En soumettant une nouvelle image segmentée automatiquement, j'ai obtenu après l'entraînement du modèle, un pourcentage de cellules correctement segmentées. Le script suggère également les paramètres à modifier dans MACiQView pour améliorer la segmentation automatique.

Après l'acquisition des images et la segmentation validée, j'ai pu caractériser les structures embryonnaires dans une approche spatiale et les valider statistiquement. Dans un premier temps, j'ai caractérisé la périphérie dorsale de la moelle épinière en décrivant une population hétérogène de cellules Sox10+, Isl1+, HuCD+ ou encore NeuN+. J'ai identifié une expression transitoire d'Isl1 dans les motoneurones. Ensuite, j'ai observé une population de cellules Syk+ au niveau de la dure-mère. Pour éviter les corrélations abusives, j'ai monté un pipeline de comparaison de clusters. Trois sous-populations Syk+ ont été décrites : mésenchymateuses/prolifératives ; immunitaires/épithéliales et gliales/neuronales. Enfin, dans la région lombo-sacrée, j'ai mis en évidence l'organe de Zuckerkandl précédemment observé en microscopie iDISCO. Il s'agit d'un organe TH+/Synaptophysine+/β3-Tubuline- structuré en Zellballen, transitoire, et impliqué dans la régulation circulatoire et métabolique fœtale.